鉴定长非编码RNA

写在前面

长非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。200个核苷酸的限制可以区分当时已知的功能非编码RNA（如miRNA、miRNA前体）和结构非编码RNA（如tRNA、rRNA）。可想而知，lncRNA是个大杂烩，种类繁多，功能复杂。

随着转录组测序的大规模应用，大量的lncRNA被发现。如果你做了一个转录组研究，可能也会有鉴定新lncRNA的需求。转录组构建之后，去掉已知的编码蛋白基因和lncRNA，留下的就是新发现的转录本。从新发现的转录本鉴定lncRNA，简单来讲，就是去掉转录噪音和去掉编码蛋白基因。

转录组测序可以分析出几万到几十万转录本，其中很大一部分是转录噪音。我们通常来讲，会去掉单外显子和低表达转录本。有人认为，RNA聚合酶II可能随机结合在DNA上，瞬时转录出一些RNA，因为不是正常的基因转录，所以会马上关闭。这些转录噪音的特征就是单外显子和低表达。

通常根据lncRNA在基因组上与蛋白质编码基因的相对位置将其分为4类：基因间长链非编码RNA（intergenic lncRNA，由基因组上编码基因之间的间隔序列转录产生，也即long intergenic ncRNA， lincRNA）、内含子长链非编码RNA（intronic lncRNA,完全由蛋白质编码基因内的内含子转录而来）、正义链非编码RNA（sense lncRNA，转录方向与蛋白质编码基因转录方向相同，并且与蛋白质编码基因外显子有部分或者全部重叠）、反义长链非编码RNA（antisense lncRNA，转录方向与蛋白质编码基因转录方向相反）。其中lincRNA争议很小，sense lncRNA和intronic lncRNA可能是基因转录错误或者转录加工得到中间产物。如果是链非特异性的库，转录本的方向是软件推断出来的，antisense lncRNA可能就是sense lncRNA，也可能是转录噪音。有些严格的一点的研究，可能只要intergenic的新转录本。

接下来是去掉编码蛋白基因，因为lncRNA特征不明显，鉴定lncRNA就变成鉴定编码蛋白基因，然后取反。有人自己编写程序去掉编码蛋白基因，比如BLAST比对已知蛋白库（不能比对上或者限制比对上的长度），再加上开放阅读框长度不能大于30（或者某个其他值）。鉴定lncRNA的工具其实很多，大家常用的套路也是综合多个工具的结果。本文推荐CPC2和CPC这两个软件。

使用CPC2鉴定lncRNA

CPC2只使用序列本身的特征，速度非常快。我现在的做法是先跑CPC2，去掉coding gene，剩下的再去跑CPC。CPC2的官方地址：http://cpc2.cbi.pku.edu.cn/download.php

a. CPC2的安装

CPC2依赖Biopython，所以我们先安装它。

pip install biopython

然后安装CPC2。

tar zxvf CPC2-beta.tar.gz
cd CPC2-beta
export CPC_HOME="$PWD"
cd libs/libsvm
tar zxvf libsvm-3.18.tar.gz
cd libsvm-3.18/
make clean && make

注意CPC2目前只支持Python2，如果你装了Anaconda，可以开一个Python2的虚拟环境。export CPC_HOME="$PWD"这句是将CPC_HOME这个环境变量设置为CPC2的主目录路径，重启终端后，这个设置就无效了。如果要永久设置可以修改~/.bashrc文件，添加export CPC_HOME="/home/chenwen/bin/CPC2-beta"，注意你的实际路径可能和我的不同。

b. 运行CPC2

cd $CPC_HOME
python ./bin/CPC2.py -i input.fa -o output.txt

使用CPC鉴定lncRNA

CPC是鉴定lncRNA经典软件，它先把未知转录本和已知蛋白库BLAST对比，BLAST的结果作为libsvm（一个机器学习分类库，CPC2也用了它）的分类特征。因为有了BLAST，可靠性更高，同时也非常慢。

CPC是个很老的软件了，它调用的是blastall，也就是老版本的BLAST，而不是新版本的BLAST+。CPC和老版本BLAST的下载地址，有些朋友可能找不到，我把它们直接放在我的网站上了。

CPC下载地址：https://static.biochen.com/software/cpc-0.9-r2.tar.gz
老版本的BLAST下载地址：https://static.biochen.com/software/blast-2.2.26-x64-linux.tar.gz

a. CPC的安装

tar -zxvf cpc-0.9-r2.tar.gz
cd cpc-0.9-r2/libs/libsvm
tar -zxvf libsvm-2.81.tar.gz
cd libsvm-2.81
make clean && make
cd ../..
tar -zxvf estate.tar.gz
cd estate
make clean && make

b. 建立BLAST库

需要使用蛋白质库，UniRef90或者NCBI的nr都可以，用formatdb命令建库时，必须命名为”prot_db”, 且放在CPC安装目录下的data目录下面。

cd cpc-0.9-r2/data
formatdb -i (your_fasta_file) -p T -n prot_db

c. 运行CPC

cd cpc-0.9-r2/
bin/run_predict.sh (input_seq) (result_in_table) (working_dir) (result_evidence)

括弧里面的内容需要改成你实际的文件名或者路径。run_predict.sh会调用远程blast，建议运行run_predict_local.sh，并把这个文件中blast_opts=”$blast_opts -a 2″; # 2CPUs, boost the performance这句话中的2，改成你实际电脑使用的CPU核数。